本制品是一种即用型PCR预混合液，含有抗体介导的快速热启动Taq DNA聚合酶，SYBR Green I荧光染料，MgCl2，dNTP Mix和一些稳定剂。提供的2×BB Fast qPCR Mix含有除引物、模板外的所有组分，用于实时qPCR过程中DNA的扩增和检测。
抗体介导的快速热启动Taq DNA聚合酶和独有的缓冲系统减少了引物二聚体的形成，增强了扩增的特异性和效率，确保了SYBR Green I实时qPCR的准确性。另外，2×BB Fast qPCR Mix中的SYBR Green I是实时PCR专用染料，对热启动Taq DNA聚合酶的酶活具有少量抑制性，因此合适浓度的SYBR Green I不仅能确保实时qPCR具有较强的荧光强度，还提高了检测的灵敏性。简单来说，就是BB Fast qPCR Master Mix具有较好的扩增效率及检测灵敏度。
DNF Buffer专用于存在多个非特异性扩增位点的引物。对于一些没有很好引物的DNA序列，DNF Buffer可根据说明书加入到反应体系中。
ROX参考染料在2×BB Fast qPCR Mix(高Rox)中为1μM，适用于需要用高浓度ROX参考染料进行校正的实时PCR仪器，如Applied Biosystems 5700，Applied Biosystems 7000，Applied Biosystems 7300，Applied Biosystems 7700，Applied Biosystems 7900，Applied Biosystems 7900HT，Applied Biosystems 7900 HT Fast，Applied Biosystems StepOne和Applied Biosystems StepOnePlus。
| 组分 | 1mL | 5mL |
| 2×BB Fast qPCR Mix(高Rox) | 1mL | 1mL×5 |
| DNF Buffer | 200μL | 1mL |
| Sterilized ddH2O | 1mL | 1mL×5 |
保存：-20℃，避免反复冻融。
- 配制反应体系
- 溶解并混匀所有组分，简单离心；
- 根据下表准备反应体系；
注：成分 用量 终浓度 2×BB Fast qPCR Mix(高Rox) 10μL 1× 10μM Forward Primer 0.4μL 200 nM 10μM Reverse Primer 0.4μL 200 nM Template DNA As required <20ng/20μL DNF Buffer (Optional) 2μL 0.5M PCR-grade water 至20μL -
① 每20μL反应体系中最多加入20ng的基因组DNA或质粒DNA；
② 每20μL反应体系中使用至多1μg总RNA反转录成的cDNA原液或稀释的cDNA。
③ DNF Buffer只加入到引物存在多个非特异扩增位点的反应体系中。普通引物勿加。
- 溶解并混匀所有组分，简单离心；
- 运行qPCR
根据下列循环程序使用两步法运行qPCR：
注：对于三步法的循环程序，在最佳退火温度下退火20 s后，根据仪器推荐设置，在72℃下设置采集数据所需的最小时间。步骤 温度 持续时间 循环数 预变性 95℃ 3min 保持 变性 95℃ 1~3 s 40 退火/延伸/数据采集 60℃ 20~30 s 溶解曲线分析 根据仪器推荐程序设置
| 问题 | 可能的原因 | 建议 |
| 荧光强度低或无 | 不正确操作 | SYBR Green I染料对光敏感；避免暴露在光下及反复冻融。使用前彻底溶解和混匀溶液。 |
| 无目的扩增产物 | 始终使用纯化过的高质量完整DNA作为模板。琼脂糖凝胶电泳分析模板完整性； 确保引物可用； 循环程序缺乏必要步骤，检查循环程序。 | |
| 引物浓度过低 | 使用引物终浓度为0.1～0.5μM。 | |
| 无模板的对照组出现阳性信号(NTC)。 | 污染 | 扔掉所有试剂，清洗所有移液枪及其表面，准备新鲜的引物贮备液等。 |
| 形成引物二聚体 | 退火温度不是最优。 检查引物设计及其特异性。 引物设计不完善。 | |
| 样品溶解曲线出现第二个非特异的峰。 | 起始模板太多 | 减少起始模板量。 |
| 延伸时间太长 | 如果使用的是三步法，根据机器指南，确保在72℃使用的延伸时间是数据采集需要的最小时间。 | |
| 引物设计不完善 | 重新设计具有良好特异性的引物。 |
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